І.В. Калінін, кандидат біол. наук, Н.М. Данченко, Б.О. Цудзевич, доктор біол. наук, проф.

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна

Резюме. В роботі наведено дані експериментальних досліджень щодо функціонування антиоксидантної системи щурів за умов інтоксикації важкими металами (міді сульфату, цинку сульфату, кадмію сульфату і свинцю азотнокислого) та при застосуванні a-ліпоєвої і фолієвої кислот. Показано, що застосування a-ліпоєвої і фолієвої кислот сприяє встановленню балансу між про- і антиоксидантами та підтримує оптимальний метаболічний баланс у клітині.
Ключові слова: мідь, цинк, кадмій, свинець, кров, печінка, щури, антиоксидантна система, a-ліпоєва кислота, фолієва кислота.

Важкі метали викликають посилення вільноради-кального окиснення та призводять до розладу антиоксидантного захисту. a-ліпоєва кислота (a-ЛК) завдяки широкому спектру дії на всі ланки метаболізму використовується при багатьох патологічних станах, у тому числі й при захворюваннях печінки та різноманітних інтоксикаціях.

Завдяки своїм унікальним фізико-хімічним властивостям a-ліпоєва кислота є реакційно здатною біологічною молекулою, яка була еволюційно створена для ряду біохімічних реакцій, необхідних для окисного метаболізму і модуляції функцій клітин [1–3].

Фолієва кислота, вітамін В₉ (ФК) виконує важливу роль у реакціях синтезу нуклеїнових кислот, білків, обміні фосфоліпідів, підвищує каталітичну активність мікросомальних монооксигеназ, позитивно впливає на функціональний стан печінки, стимулює жовчовиділення, зменшує жирову інфільтрацію печінки, викликану дефіцитом холіну в їжі. Наявність у птериновій частині молекули ФК гідроксильних груп і третинних атомів нітрогену дозволяє зв’язувати важкі метали [4, 5].

Метою роботи було дослідження функціонування антиоксидантної системи щурів за умов інтоксикації важкими металами (міді сульфату, цинку сульфату, кадмію сульфату і свинцю азотнокислого) та при застосуванні a-ліпоєвої і фолієвої кислот.

Матеріали і методи

Досліди проводили на білих нелінійних щурах-самцях, одного віку, масою 180–200 г., впродовж 14 діб. Було утворено п’ять груп тварин: перша — інтактні (контроль), друга — тваринам перорально вводили розчин міді сульфату в дозі 3 мг/кг, що становить 1/10 від ЛД₅₀, третя — щурам пероpально вводили розчин цинку сульфату в дозі 2 мг/кг, що становить 1/20 від ЛД₅₀, четверта — тваринам перорально вводили розчин кадмію сульфату в дозі 1,5 мг/кг, що становить 1/30 від ЛД₅₀, п’ята — тваринам перорально вводили розчин свинцю азотнокислого в дозі 1,7 мг/кг, що становить 1/50 від ЛД₅₀. Після інтоксикації здійснювали введення ФК в дозі 0,1 мг/кг та a-ЛК із розрахунку 100 мг/кг ваги один раз на добу впродовж 10 діб. Щурів декапітували під ефірним наркозом і відбирали тканини крові та печінки для подальших досліджень. Вся робота проводилась відповідно до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин, яких використовують у наукових цілях. Кров отримували загальновідомими методами, а препарати гомогенної фракції клітин печінки — методом диференційного центрифугування [6]. Вміст ТБК-активних продуктів визначали за [7], дієнових кон’югатів (ДК) за [8]. Визначали активність: супероксиддисмутази (СОД. КФ 1.15.1.1) за методом [9]; каталази (КАТ, КФ 1.11.1.9) за [10]; глутатіонпероксидази (ГП, КФ 1.11.1.9) та глутатіон-трансферази (ГТ, КФ 2.5.1.18) за [11–12]. Вміст відновленого глутатіону (GSH) визначали методом [13]. Експериментальні дані обробляли статистично з використанням t-критерію Стьюдента [14].

Результати та обговорення

Результати досліджень антиоксидантної системи у тканинах інтоксикованих щурів після застосування a-ліпоєвої і фолієвої кислот наведено в таблицях 1–3.

У крові та тканинах печінки щурів при інтоксикації іонами міді, цинку, кадмію і свинцю виявлено активацію пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ), яке оцінювали по накопиченню ТБК-активних продуктів.

Інтоксикація міді сульфатом призводить до збільшення ТБК-активних продуктів на 40% у крові та на 31% у печінці; цинку сульфатом — на 42% в крові та на 31% в печінці, кадмію сульфатом — на 66% в крові та на 38% в печінці; свинцем азотнокислим — на 61% в крові та на 36% в печінці відносно контрольної групи тварин.

Після інтоксикації іонами важких металів збільшується вміст дієнових кон’югатів (ДК) (табл. 1) у крові та печінці щурів. Так, у крові вміст ДК збільшився на 16 % при інтоксикації міді сульфатом, на 18 % — цинку сульфатом, на 24 % — кадмію сульфатом, на 26 % — свинцем азотнокислим порівняно з контрольною групою.

Таблиця 1

Вміст ТБК-активних продуктів і дієнових кон’югатів у крові та печінці щурів за умов інтоксикації важкими металами та при застосуванні a-ліпоєвої і фолієвої кислот (М±m, n=8)

Антиоксидантна система захисту організму контролює і гальмує всі етапи вільнорадикальних реакцій, починаючи від їхньої ініціації та закінчуючи утворенням гідроперекисів та МДА. Інтоксикація іонами важких металів призводить до зниження активності СОД і КАТ у досліджуваних тканинах щурів (табл. 2), особливо при інтоксикації іонами кадмію та свинцю.

Таблиця 2

Активність супероксиддисмутази (СОД) та каталази (КАТ) у крові та печінці щурів за дії іонів важких металів та при застосуванні a-ЛК і ФК (М±m, n=8)

Ймовірно таке зниження можна пояснити ушкодженням молекули ферменту, а також підвищенням концентрації гідроген пероксиду внаслідок активації окисних процесів і порушенням реакцій окисного фосфорилювання та інших метаболічних процесів. У деяких випадках для реалізації активності СОД і КАТ важливим фактором є наявність мікроелементів, а порушення гомеостазу міді та цинку, внаслідок токсичної дії, створює умови для патологічних процесів.

У крові щурів (табл. 3) за умов інтоксикації міді сульфатом зменшується: активність ГП на 22 %, ГТ на 47 % і вміст відновленого глутатіону на 23 %; цинку сульфату — активність ГП на 23 %, ГТ на 50 % і GSH на 27 %; кадмію сульфату — ГП на 38 %, ГТ на 60 % і GSH на 34 %; свинцю азотнокислого — ГП на 34 %, ГТ на 57 % і GSH на 31 % відповідно, у порівнянні з контрольною групою тварин.

Таблиця 3

Активність глутатіонпероксидази (ГП) і глутатіонтрансферази (ГТ) та вміст відновленого глутатіону (GSH) в крові та печінці щурів за дії іонів важких металів та при застосуванні a-ЛК і ФК (М±m, n=8)

За умов інтоксикації міддю сірчанокислою і цинку сульфатом активність ГП і ГТ у печінці щурів змінюється незначно. Активність у печінці ГП і ГТ за умов дії іонів кадмію зменшується на 25 % і 19 % відповідно, порівняно з контролем. При дії іонів свинцю активність ГП і ГТ у печінці щурів зменшилась на 19 % і 15 % відповідно, у порівнянні з контрольними тваринами.

Слід відзначити, що більш інтенсивно зменшувався вміст відновленого глутатіону в печінці інтоксикованих щурів: CuSO₄ — на 17 % , ZnSO₄ — на 23 %, CdSO₄ — на 61 %, Pb(NO₃)₂ — на 51 %, відносно контрольної групи тварин. Таку зміну, на наш погляд, можна пояснити тим, що глутатіон бере участь у захисних реакціях клітинних органел.

Таким чином, аналіз одержаних результатів вказує на порушення проокисно-антиоксидантної рівноваги. Слід відзначити, що саме глутатіонпероксидазна система, є універсальною при розкладі пероксидів і перешкоджає ініціації вторинних реакцій окиснення ліпідів та бере участь у інактивації продуктів окисного метаболізму ксенобіотиків.

Введення щурам a-ліпоєвої кислоти сприяло збільшенню вмісту GSH та активності досліджуваних ферментів у печінці порівняно з інтоксикованими тваринами, які не отримували вказаний препарат.

Призначення щурам фолієвої кислоти послаблює негативний вплив важких металів на організм щурів і позитивно впливає на показники АОС.

Отже, a-ЛК є метаболічним стимулятором і антиоксидантом, володіє широким спектром позитивних ефектів на хімічні та фізичні агенти, які призводять до метаболічних порушень.

Застосування ФК проявляє антиоксидантний ефект, що необхідно враховувати в комплексному захисті живого організму від токсичних впливів важких металів.

Висновок

Застосування фолієвої і a-ліпоєвої кислот сприяє підвищенню активності супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази, глутатіон-трансферази і відновленого глутатіону у тканинах інтоксикованих щурів, що сприяє встановленню балансу між про- і антиоксидантами та підтримує оптимальний метаболічний баланс у клітині.

ЛІТЕРАТУРА

1. Трахтенберг И.М. Современные аспекты применения a-липоевой кислоты при экзогенных токсических воздействиях (обзор литературы) / И.М. Трахтенберг, О.В. Ермакова, И.П. Лубянова // Совр. пробл. токсикол. –2005. –№ 3. –С. 27–31.

2. Biewenga G.P. The pharmacology of the antioxidant lipoic acid / G.P. Biewenga, G.R. Haenen, A. Bast // Gen Pharmacol. –1997. –Vol. 29, № 3. –P. 315.

3. (R)-alfa-lipoic acid-supplemented old rats have improved mitochondrial function, decreased oxidative damage, and increased metabolic rate / T.M. Hagen, R.T. Ingersoll, J. Lykkesfeldt [et al.] // FASEB J. –1999. –Vol. 13, № 2. — P. 411–418.

4. Shooshtari M.K. Memory and motor coordination improvement by folic Acid supplementation in healthy adult male rats / M.K. Shooshtari, A.A. Moazedi, G.A. Parham // Iran J. Basic Med. Sci. –2012. –Nov. 15(6). –P. 1173–1179.

5. The Effect of Folate Supplementation on Methotrexate Efficacy and Toxicity in Psoriasis Patients and Folic Acid Use by Dermatologists in the USA / A. Al-Dabagh, S.A. Davis, M.A. Kinney [et al.] // Am. J. Clin. Dermatol. –2013.–Jun. 14(3). — P. 155–161.

6. Практикум по биохимии: учебное пособие / [под ред. С.Е.Северина, Г.А. Соловьевой] –М.: Из-во МГУ, 1989. –509 с.

7. Современные методы в биохимии / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили [под ред. В.Н. Ореховича] –М. Медицина, 1977. –С. 66–68.

8. Гаврилов В.Б. Измерение диеновых коньюгатов в плазме крови по УФ-поглощению гептановых и изопропанольных экстрактов / В.Б. Гаврилов, А.Р. Гаврилова, Н.Ф. Хмара // Лабораторное дело. –1988. –№ 2. –С. 60–63.

9. Орехович В.Н. Современные методы в биохимии / В.Н. Орехович. –М.:Медицина, 1977. –268 с.

10. Королюк М.А. Метод определения активности каталазы в биологическом материале / М.А. Королюк // Лабораторное дело. –1988. –№2. –С. 31–34.

11. Mannervik B. Glutathione peroxidase / B. Mannervik // Methods in enzymology. Acad. Press. –1985. –Vol. 113. –P. 490–495.

12. Власова С.Н. Активность глутатионзависимых ферментов эритроцитов при хронических заболеваниях печени у детей / С.Н. Власова, Е.И. Шабунина, А.И. Переслегина // Лаб. дело. –1990. –№ 8. –С. 19–21.

13. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups / G.L. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. –1959. –V. 82, N1. –Р. 70–77.

14. Кучеренко М.Є. Сучасні методи біохімічних досліджень / М.Є. Кучеренко, Ю.Д. Бабенюк, В.М. Войціцький. –К.: Фітосоціоцентр, 2001. –С. 109–152.

REFERENCES

1. Trakhtenberg I.M. Sovremennye aspekty primeneniya a-lipoevoj kisloty pri ekzogennykh toksicheskikh vozdejstviyakh (obzor literatury) / I.M. Trakhtenberg, O.V. Ermakova, I.P. Lubyanova // Sovr. probl. toksikol. –2005. –№ 3. –S. 27–31.

2. Biewenga G.P. The pharmacology of the antioxidant lipoic acid / G.P. Biewenga, G.R. Haenen, A. Bast // Gen Pharmacol. –1997. –Vol. 29, № 3. –P. 315.

3. (R)-alfa-lipoic acid-supplemented old rats have improved mitochondrial function, decreased oxidative damage, and increased metabolic rate / T.M. Hagen, R.T. Ingersoll, J. Lykkesfeldt [et al.] // FASEB J. –1999. –Vol. 13, № 2. — P. 411–418.

4. Shooshtari M.K. Memory and motor coordination improvement by folic Acid supplementation in healthy adult male rats / M.K. Shooshtari, A.A. Moazedi, G.A. Parham // Iran J. Basic Med. Sci. –2012. –Nov. 15(6). –P. 1173–1179.

5. The Effect of Folate Supplementation on Methotrexate Efficacy and Toxicity in Psoriasis Patients and Folic Acid Use by Dermatologists in the USA / A. Al-Dabagh, S.A. Davis, M.A. Kinney [et al.] // Am. J. Clin. Dermatol. –2013.–Jun. 14(3). — P. 155–161.

6. Praktikum po biokhimii: uchebnoe posobie / [pod red. S.E.Severina, G.A. Solov'evoj] –M.: Iz-vo MGU, 1989. –509 s.

7. Sovremennye metody v biokhimii / I.D. Stal'naya, T.G. Garishvili [pod red. V.N. Orekhovicha] –M. Medicina, 1977. –S. 66–68.

8. Gavrilov V.B. Izmerenie dienovykh kon'yugatov v plazme krovi po UF-pogloscheniyu geptanovykh i izopropanol'nykh ekstraktov / V.B. Gavrilov, A.R. Gavrilova, N.F. Khmara // Laboratornoe delo. –1988. –№ 2. –S. 60–63.

9. Orekhovich V.N. Sovremennye metody v biokhimii / V.N. Orekhovich. –M.:Medicina, 1977. –268 s.

10. Korolyuk M.A. Metod opredeleniya aktivnosti katalazy v biologicheskom materiale / M.A. Korolyuk // Laboratornoe delo. –1988. –№2. –S. 31–34.

11. Mannervik B. Glutathione peroxidase / B. Mannervik // Methods in enzymology. Acad. Press. –1985. –Vol. 113. –P. 490–495.

12. Vlasova S.N. Aktivnost' glutationzavisimykh fermentov eritrocitov pri khronicheskikh zabolevaniyakh pecheni u detej / S.N. Vlasova, E.I. Shabunina, A.I. Pereslegina // Lab. delo. –1990. –№ 8. –S. 19–21.

13. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups / G.L. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. –1959. –V. 82, N1. –Р. 70–77.

14. Kucherenko M.Ye. Suchasni metody biokhimichnykh doslidzhen' / M.Ye. Kucherenko, Yu.D. Babenyuk, V.M. Vojcic'kyj. –K.: Fitosociocentr, 2001. –S. 109–152.

Надійшла до редакції 05.06.2013 р.