Вопросы выявления и идентификации штаммов Legionella pneumophila в воде

  • Авторы: С.Н. Кузьминский
  • УДК: 579.841:579.68
Скачать вложения:

С.М. Кузьминский

Научный центр превентивной токсикологии, пищевой и химической безопасности имени академика Л.И. Медведя МЗ Украины, г. Киев

Резюме. Цель публикации — аналитический обзор литературы и определение путей для преодоления существующих проблем. Инфекции, обусловленные Legionella spp., в последнее время рассматриваются как растущая угроза для здравоохранения, связанная с высокой заболеваемостью и летальностью. В соответствии со стандартом ИСО только те колонии, которые растут на БУД-агаре и не растут на кровяном агаре считают подозрительными на принадлежность к роду Legionella. Окончательная идентификация возможна лишь с помощью PCR-метода. Но культуральный метод имеет ряд ограничений, которые делают его недостаточно пригодным для оперативных противоэпидемических мероприятий. Для мониторинга безопасности воды и профилактики легионеллеза необходима разработка новых методов, которые бы сочетали специфичность выявления легионелл с возможностью различения жизнеспособных и нежизнесопобных микробных клеток.

Ключевые слова: Legiоnella pneumophila, вода, идентификация, ПЦР-метод.

Бактерії роду Legionella достатньо поширені у зовнішньому середовищі, насамперед у різноманітних водних системах як природних, так і створених людиною та вологому ґрунті [1, 2, 3]. Переважно вони паразитують у клітинах водних амеб та інших найпростіших та не становлять істотної небезпеки для людини (так звані “некультурабельні” форми). Оптимальною для розмноження легіонел є температура 25°-45°С, хоча цей процес відбувається і за більш низьких температур. Умови для розмноження легіонел у штучних водних системах (системи охолодження, компресорні пристрої, фонтани, плавальні басейни, гідромасажні ванни та інше) є більш сприятливими, ніж у природних, що призводить до їхнього накопичування у високих концентраціях. На поверхнях водопровідного устаткування в асоціації з іншими бактеріями та найпростішими легіонели утворюють біоплівки, які ефективно захищають їх від впливу дезінфектантів. Останнім часом виявлення L. pneumophyla набуває все більшої актуальності для санітарної мікробіології харчових продуктів, насамперед при контролюванні безпечності води на виробництві бутильованої питної води та безалкогольних напоїв. Зокрема пропонується включати ці дослідження до переліку рекомендованих для мікробіологічного моніторингу гігієнічного стану виробництва.

До роду Legionella належать понад 50 видів, які становлять 71 окрему серогрупу [2, 4]. З них найбільш цікавою для медичної мікробіології є L. pneumophyla серогрупи 1, яка у 80% випадків є збудником «хвороби легіонерів» — гострої інфекційної пневмонії, яка вперше вразила делегатів з'їзду Американського легіону у Філадельфії в 70-х роках минулого сторіччя [5]. Джерелом інфекції виявилась вода з системи кондиціонування повітря. Окрім того, щонайменше ще 21 вид легіонел (у т.ч. L. micdadei, L. longbeachae, L. dummqfii L. bozemanii) пов'язують з різноманітними інфекційними захворюваннями переважно в імунокомпрометованих паціентів, які знаходяться в лікувальних закладах [6]. Інкубаційний період становить 2–10 діб. Летальність у цих випадках доволі висока [7]. Зараження відбувається шляхом інгаляції інфікованих крапель аерозолю [8, 9]. Висока концентрація в краплинах дрібнодисперсного аерозолю дозволяє збуднику потрапляти до легеневих альвеол, де вірулентні штами легіонел інфікують макрофаги і тривалий час зберігаються в них. Зараження можливе і шляхом ковтання інфікованої води без утворення аерозолю (басейни, ємності для питної води тощо).

Наявність L. pneumophila в різноманітних водних системах у кількості до 102 живих клітин/л вважають допустимим, концентрація 102–103 свідчить про колонізацію даного об'єкту, яка сама по собі не становить небезпеки, але потребує регулярного мікробіологічного моніторингу, концентрація 104 і більше є ознакою епідемічної загрози, що вимагає проведення дезінфекційних та профілактичних заходів [10]. До 30 % спорадичного легіонельозу становлять випадки під час туристичних подорожей (насамперед корабельні круїзи), причому захворювання проявляється після повернення з поїздки. Основним запобіжним заходом є локалізація та знешкодження збудника у водній системі, яка може бути джерелом бактеріального аерозолю. Випадків передачі інфекції від людини до людини не виявлено. Швидке та безпомилкове виявлення легіонел у водному середовищі має ключове значення в системі заходів боротьби та запобігання легіонельозній інфекції.

Бактерії роду Legionella є ауксотрофами за L-цистеїном і не ростуть на поживних середовищах без цієї амінокислоти. Ця біологічна особливість використовується в культуральному методі виявлення легіонел у довкіллі. Ізоляти, які ростуть на буферному вугільно-дріжджовому агарі (аналог середовища BCYE), але не здатні до росту на цьому середовищі без L-цистеїну, попередньо ідентифікують як такі, що належать до роду Legionella [11, 12]. Проте культуральний (мікробіологічний) метод виявлення легіонел у водному середовищі, який прописаний в стандарті ISO [13] та AFNOR [14], має суттєві обмеження, пов'язані із занадто довгим терміном культивування (7–10 діб), недостатньою селективністю поживних середовищ (можливий ріст нецільових мікроорганізмів), нездатністю виявляти живі, але “некультурабельні” клітини (легіонели, які перебувають в асоціації з амебами) та зменшенням життєздатності легіонел на етапі концентрації та деконтамінації, часткове пригнічення антибіотиками в поживних середовищах [11, 15]. Отже, виявлення легіонел в пробах води, насамперед з природних водойм, є нечастою подією, яка до того ж вимагає тривалого часу та значної трудомісткості [16]. Значно ускладненим також є виявлення культуральним методом мікробних клітин, які мають фізіологічні пошкодження внаслідок дії несприятливих умов довкілля або сублетальних концентрацій дезінфектантів. Успішне отримання чистої культури з низькоконтамінованого середовища, масивно забрудненого нецільовими мікроорганізмами, вимагає попередньої концентрації (центрифугуванням або ж фільтрацією) та застосування засобів селекції. До таких належать антибіотики (поліміксин В, ванкоміцин, циклогексамід), прогрівання (50°С 30 хв.) або витримка в кислому середовищі (рН 2,2 5 хв.) [13]. Температура має пріоритетне значення в підвищенні висіваємості легіонел з води [17]. Sanden із співавторами [18] показали, що преінкубація води з життєздатними амебами протягом 7 діб збільшує можливість знахідок L.pneumophila. Bartie із співавторами продемонстрували полегшення росту легіонел на селективних середовищах після преінкубації водних концентратів з автохтонними амебами [19].

Видова ідентифікація легіонел також є непростим завданням. Легіонели є хемоорганотрофами (не ферментують вуглеводи), не виявляють уреазної та нітратредуктазної активності [20], отже, традиційні для мікробіології біохімічні методи в даному випадку є малоінформативними, невалідованими і мають обмежене застосування [21]. Більшість штамів розріджують желатин, продукують каталазу, але не продукують оксидазу. L.pneumophila та деякі інші види можуть гідролізувати гіпурат [22, 23]. Визнано, що більш точна ідентифікація L. pneumophila можлива за допомогою серологічних (латекс-аглютинація, прямий імунофлюоресцентний метод) та молекулярно-генетичних методів (різноманітні PCR-методи для виявлення 1SrRNA, 5SrRNA, 23SrRNA генів та mip-гену, що є геном-потенціатором інфективності L. pneumophila для макрофагів [11]. Найбільш прийнятним є поєднання згаданих методів ідентифікації з культуральним методом виявлення L. pneumophila [10, 24]. Такий підхід набуває особливої ваги у зв'язку з недавньою публікацією Borges A. із співавторами [25]. Авторами показано, що жоден з 49 штамів, попередньо ідентифікованих культуральним методом як L. pneumophila за результатами молекулярно-генетичного дослідження (16SrRNA) не міг бути віднесений до роду Legіonella. Автори наголошують, що ідентифікація легіонел лише за культуральними ознаками може призвести до хибних результатів, що матиме серйозні наслідки. Кількісну PCR у реальному часі (qPCR) розглядають як альтернативний культуральному мікробіологічному методу виявлення вибагливих бактерій, що повільно ростуть на поживних середовищах. Ампліфікація ДНК легіонел шляхом полімеразно-ланцюгової реакції дозволяє за відносно короткий час і за великої кількості проб чітко ідентифікувати більшість видів легіонел, в тому числі і в “некультурабельній” формі. У той же час, недоліком PCR-методу є неможливість розрізнення живих та неживих клітин мікроорганізмів, що істотно ускладнює інтерпретацію результатів.

Отже, PCR-аналіз не може повною мірою замінити класичний мікробіологічний метод. Експрес-методи, які поєднували б специфічну детекцію та виокремлення життєздатних клітин легіонел, лишаються нагальною потребою ефективного моніторингу безпечності води та профілактики легіонельозу.

 

ЛІТЕРАТУРА

1. Taylor M. Legionella, Protozoa and biofilms: Interactions within complex microbial systems /M. Taylor , K.Ross, R.Benthham // Microb. Ecol. — 2009. — №58. — P. 538–547.

2. Legionella impletisoli sp. nov. and Legionella yabuuchiae sp. nov., isolated from doils contaminated with industrial wastes in Japan /H.Kuroki., H.Miyamoto, K.Fukuda, [et al.]//Syst.Appl.Microbiol. — 2007. — №30. — P. 273–279.

3. Alp E. Ventilator assosiated pneumonia and infection control /E.Alp, A.Voss// Ann.Clin.Microbiol. Antimicrob. — 2006. — №5. — P. 1–11.

4. Tronel H. Overview of diagnostic and detection methods for legiionellosis and Legionella spp./ H.Tronel, P. Hartmann // Lett.Appl.Microbiol. —2009. —№48. —P. 653–656.

5. Fraser D. Legionnaires' diseases. Description of an epidemic of pneumonia /D.W. Fraser, T.R. Tsai, W. Orenstein //N.Engl. J. Med. — 1977. — №297. — P. 1189–1197.

6. Multicenter comparison of molecular methods for detection of Legionella spp. in spurum samples / M. Bencini, A.Van den Brule, E. Claas [et al.]// J. Clin. Microbiol. — 2007. — №45. — P. 3390–3392.

7. Integrated real-time PCR for detection and monitoring of Leginella pneumophila in water systems/ D.Yaradou, S. Hallier-Soulier, S.Moreau, [et al.]// Appl.Environ. Microbiol. — 2007. — №73. — P. 1452–1456.

8. Diederen B. Legionella spp. And Legionnaires' disease /B.Diedren// J.Infect. — 2008. — № 56. — P. 1–12.

9. Legonnaires' disease in immunocompromised patients:A case report of Legionella longbeachae pneumonia and review of the literature/ P.Kumpers, A.Tide, P.Kirschner [et al.]// J.Med.Microbiol. — 2008. — №57. — P. 384–387.

10. Выявление бактерий Legionella pneumophila в объeктах окружающей среды. — (Методические указания) / Г.Ф. Лазикова, Ю.М. Федоров, И.В. Брагина [и др.]: МУК 4.2.2217-07. М. — 2007. — 24 с.

11. Rapid method for enumeration of viable Legionella pneumophila and other Legionella spp. in water /P.Delgado-Viscogliosi, T. Simonart, V.Parent [et al.] //Appl.Environ. Microbiol. — 2005. — №71. — P. 4086–4096.

12. The rapid and specific real-time detection of Legionella pneumophila in water samples using Optical Waveguide Lightmode Spectroscopy/I.Cooper, S.Meikle, G.Standen [et al.]//J.Microbiol.Methods. — 2009. — №78. — P. 40–44.

13. International Standards Organisation /Water quality-detection and enumeration of Legionella//International standart ISO 11731. — 1998. — Geneva, Switzerland.

14. Association Francaise de Normalisation. Water quality. Detection and enumeration of Legionella spp. аnd Legionella pneumophila. Method by direct inoculation and after concentration by membrane filtration of centrifugation /AFNOR// NF T90–431. — 2003. — La Plaine Saint-Denis, France.

15. Specific real-time PCR for simultaneous detection and identification of Legionella pneumophila serogroup 1 in water and clinical samples / N.Merault, C. Rusniok, S.Jarraund [et al.]// Appl. Environ. Microbiol. — 2011. — №77. — P.17 08–1717.

16. Evaluation of a Legionella urinary antigen enzyme immunoassay for rapid detection of Leginella pneu-mophila in water samples /S. Blanco, C. Prat, M. Sanches [et al.] //Int. J. Hyg. Environ. Health. — 2008. — №211. — P. 168–171.

17. Studies on the efficacy of Chloramine T trihydrate (N-chloro-p-toluene sulfonamide) against planktonic and sessile populayions of different Legionella pneumophila strains / N.Ozlem Samli-Yurudu, A. Kimiran-Erdem, A. Cotuk [et al.] Int. J. Hyg. Environ. Health. — 2007. — № 210. — P. 147–153.

18. Incubation of water samples containing amoebae improves detection of Legionellae by the culture method / G.Sanden, W. Morril, B. Fields [et al.]//Appl. Environ. Microbiol. — 1992. — № 58. — P. 2001–2004.

19. Bartie C. Identification methods for Legionella from environmental samples /C.Bartie, S. Venter, L. Nel// Water Res. — 2003. — №37. — P. 1362–1370.

20. Murray P. Legionella./P.Murray, K.Rosenthal, M. Pfaller (eds.) //In.: Nedical Microbiology. — 2005. — 5 th edn. — Elvester Science. — P. 391–340.

21. Murdoch D. Diagnosis of Legionella infection. /D.Murdoch // Clin.Infect. Dis. — 2003. — №36. — P. 64–69.

22. Edelstein P. Legionella species and Legionnaires' disease /P.Edelstein, N. Cianciotto // Procaryotes. — 2006. — № 6. — P. 988–1033.

23. Legionella and the prevention of legionellosis /J. Bartram, Y. Chartier, J. Lee [et al.] // World Health Organization (WHO). — Geneva. SBN: 9241562978.

24. Novel PCR-probe assay for detection of and discrimination between Legionella pneumophila and other Legionella species in clinical samples /A.van der Zee, H.Verbakel, C. De Jong [et al.] //J.Clin.Microbiol. — 2002. — № 40. — P. 1124–1125.

25. Detecton of Leginella spp. In natural and man-made water systems using standard guidelines /A.Borges, M.Simoes, A.Martinez-Murcia [et al.] //J. Microbiol Res. — 2012. — № 2 (4). — P. 95–102.

 

REFERENCES

1. Taylor M. Legionella, Protozoa and biofilms: Interactions within complex microbial systems /M. Taylor , K.Ross, R.Benthham // Microb. Ecol. — 2009. — №58. — P. 538–547.

2. Legionella impletisoli sp. nov. and Legionella yabuuchiae sp. nov., isolated from doils contaminated with industrial wastes in Japan /H.Kuroki., H.Miyamoto, K.Fukuda, [et al.]//Syst.Appl.Microbiol. — 2007. — №30. — P. 273–279.

3. Alp E. Ventilator assosiated pneumonia and infection control /E.Alp, A.Voss// Ann.Clin.Microbiol. Antimicrob. — 2006. — №5. — P. 1–11.

4. Tronel H. Overview of diagnostic and detection methods for legiionellosis and Legionella spp./ H.Tronel, P. Hartmann // Lett.Appl.Microbiol. —2009. —№48. —P. 653–656.

5. Fraser D. Legionnaires' diseases. Description of an epidemic of pneumonia /D.W. Fraser, T.R. Tsai, W. Orenstein //N.Engl. J. Med. — 1977. — №297. — P. 1189–1197.

6. Multicenter comparison of molecular methods for detection of Legionella spp. in spurum samples / M. Bencini, A.Van den Brule, E. Claas [et al.]// J. Clin. Microbiol. — 2007. — №45. — P. 3390–3392.

7. Integrated real-time PCR for detection and monitoring of Leginella pneumophila in water systems/ D.Yaradou, S. Hallier-Soulier, S.Moreau, [et al.]// Appl.Environ. Microbiol. — 2007. — №73. — P. 1452–1456.

8. Diederen B. Legionella spp. And Legionnaires' disease /B.Diedren// J.Infect. — 2008. — № 56. — P. 1–12.

9. Legonnaires' disease in immunocompromised patients:A case report of Legionella longbeachae pneumonia and review of the literature/ P.Kumpers, A.Tide, P.Kirschner [et al.]// J.Med.Microbiol. — 2008. — №57. — P. 384–387.

10. Vyyavlenie bakterij Legionella pneumophila v ob'ektakh okruzhayuschej sredy. — (Metodicheskie ukazaniya) / G.F. Lazikova, Yu.M. Fedorov, I.V. Bragina [i dr.]: MUK 4.2.2217-07. M. — 2007. — 24 s.

11. Rapid method for enumeration of viable Legionella pneumophila and other Legionella spp. in water /P.Delgado-Viscogliosi, T. Simonart, V.Parent [et al.] //Appl.Environ. Microbiol. — 2005. — №71. — P. 4086–4096.

12. The rapid and specific real-time detection of Legionella pneumophila in water samples using Optical Waveguide Lightmode Spectroscopy/I.Cooper, S.Meikle, G.Standen [et al.]//J.Microbiol.Methods. — 2009. — №78. — P. 40–44.

13. International Standards Organisation /Water quality-detection and enumeration of Legionella//International standart ISO 11731. — 1998. — Geneva, Switzerland.

14. Association Francaise de Normalisation. Water quality. Detection and enumeration of Legionella spp. аnd Legionella pneumophila. Method by direct inoculation and after concentration by membrane filtration of centrifugation /AFNOR// NF T90–431. — 2003. — La Plaine Saint-Denis, France.

15. Specific real-time PCR for simultaneous detection and identification of Legionella pneumophila serogroup 1 in water and clinical samples / N.Merault, C. Rusniok, S.Jarraund [et al.]// Appl. Environ. Microbiol. — 2011. — №77. — P.17 08–1717.

16. Evaluation of a Legionella urinary antigen enzyme immunoassay for rapid detection of Leginella pneu-mophila in water samples /S. Blanco, C. Prat, M. Sanches [et al.] //Int. J. Hyg. Environ. Health. — 2008. — №211. — P. 168–171.

17. Studies on the efficacy of Chloramine T trihydrate (N-chloro-p-toluene sulfonamide) against planktonic and sessile populayions of different Legionella pneumophila strains / N.Ozlem Samli-Yurudu, A. Kimiran-Erdem, A. Cotuk [et al.] Int. J. Hyg. Environ. Health. — 2007. — № 210. — P. 147–153.

18. Incubation of water samples containing amoebae improves detection of Legionellae by the culture method / G.Sanden, W. Morril, B. Fields [et al.]//Appl. Environ. Microbiol. — 1992. — № 58. — P. 2001–2004.

19. Bartie C. Identification methods for Legionella from environmental samples /C.Bartie, S. Venter, L. Nel// Water Res. — 2003. — №37. — P. 1362–1370.

20. Murray P. Legionella./P.Murray, K.Rosenthal, M. Pfaller (eds.) //In.: Nedical Microbiology. — 2005. — 5 th edn. — Elvester Science. — P. 391–340.

21. Murdoch D. Diagnosis of Legionella infection. /D.Murdoch // Clin.Infect. Dis. — 2003. — №36. — P. 64–69.

22. Edelstein P. Legionella species and Legionnaires' disease /P.Edelstein, N. Cianciotto // Procaryotes. — 2006. — № 6. — P. 988–1033.

23. Legionella and the prevention of legionellosis /J. Bartram, Y. Chartier, J. Lee [et al.] // World Health Organization (WHO). — Geneva. SBN: 9241562978.

24. Novel PCR-probe assay for detection of and discrimination between Legionella pneumophila and other Legionella species in clinical samples /A.van der Zee, H.Verbakel, C. De Jong [et al.] //J.Clin.Microbiol. — 2002. — № 40. — P. 1124–1125.

25. Detecton of Leginella spp. In natural and man-made water systems using standard guidelines /A.Borges, M.Simoes, A.Martinez-Murcia [et al.] //J. Microbiol Res. — 2012. — № 2 (4). — P. 95–102.

 

Надійшла до редакції 15.04.2014